Semliki Forest virus based vectors and cell lines for studying the replication and interactions of alphaviruses and hepaciviruses

Abstract

Semliki Forest virus (SFV; genus Alphavirus) has provided basic knowledge on the molecular biology of alpha­viruses, but also elucidated several general viral and cellular processes. The simple genomic organization of alphaviruses and their efficient propa­gation in cell culture have made alphavirus-based vectors promising tools for both DNA and RNA vaccination as well as for anti-cancer therapy. For these same reasons, alphavirus-based vectors can be potent systems for biotechno­logical applications. This thesis focuses on the properties of the non-structural protein 1 (nsP1) of SFV and the development and utility of novel SFV-based vector systems. Studies of the properties of SFV nsP1 and its non-palmitoylated variants revealed that mutations in the nsP1 palmitoylation site significantly reduce the infectivity of SFV genomes or SFV-based replicons. During infection of cell cultures, positively selected viruses with compensatory mutations emerged. It was found that nsP1, carrying the initial mutation, had an altered subcellular localization and was not able to interact with the polymerase subunit of the alphavirus replicase complex. The introduction of respective compensatory mutations restored, at least in part, these properties. As a part of studies, novel SFV replicon vectors expressing anti-apoptotic bcl-2 were constructed and analyzed. Although bcl-2 was expressed at high levels, its presence did not prolong the expression of a marker gene nor rescue the infected cells from virus-induced death. At the same time, these bicistronic vectors were found to be suitable for synchronic and transient expression of two genes of interest. Additio­nally, SFV-based vectors were successfully used to demonstrate an interaction between non-structural proteins of hepatitis C virus (HCV). Semliki Forest viirus (SFV) kuulub perekonda Alphavirus sugukonnas Togavi­ridae. Lihtsa ülesehituse ja efektiivse paljunemise tõttu on alfa­viirused olnud oluliseks töövahendiks erinevate viiruslike ning rakuliste protses­side kirjeldamisel; samas on alfaviirustel-põhinevad vektorid palju­tõotavad geeni- või kasvajavastases teraapias ning biotehnoloogias. Käesoleva töö eesmärkideks oli uurida SFV mittestruktuurse valgu nsP1 ning tema erinevate mittepalmitüleeritud vormide mõju viirusnakkusele ning peremeesrakule. Samuti uuriti võimalust takistada anti-apoptootilise valgu bcl-2 ekspressiooni abil SFV poolt põhjustatud apoptoosi ning kasutati SFV-l põhi­nevaid vektoreid C-hepatiidi viiruse proteaaside interaktsioonide kirjelda­miseks. Uurimine näitas, et palmitüleerimist takistavate mutatsioonide sisseviimine nsP1 kodeerivasse alasse vähendas järsult viiruse paljunemise efektiivsust. Samas taastasid replikatsiooni käigus tekkinud ja selekteerunud kompenseeriva toimega mutatsioonid RNA-de nakkuslikkuse ja viiruse paljunemise efektiivsuse. Leiti, et mitte-palmitüleeritud mutantide funktsionaalset defekti ei põhjustanud palmitüleerimise kui sellise puudumine, vaid hoopis nsP1 mutantsete vormide võimetus seonduda SFV polümeraasi katalüütilise subühikuga. Uudsete bitsistroonsete SFV replikon-vektorite abil leiti, et vähemalt BHK-21 rakkudes ei takista bcl-2 ekspressioon SFV indutseeritud apoptoosi. Samas on konstrueeritud vektorid efektiivseteks töövahenditeks juhtudel kui on vaja transientselt ja sama-aegselt ekspresseerida kahte uuritavat valku. SFV-vektorite kasutamisel näidati, et C-hepatiidi viiruse proteaasid NS2 ja NS3 moodustavad omavahel kompleksi. Samuti leiti, et kompleksi moodustumine ei sõltu peremeesraku tüübist ega sellest, kas vastavad valgud on ekspresseeritud paarikaupa või ühise eelvalgu kujul.